古希腊著名的物理学家阿基米德曾经说过：“给我一个支点，我就可以撬动整个地球”，那么对于学生物的童鞋来说，给你一个基因，你知道如何去研究吗？对于常见的编码基因，想必大部分人都知道怎么研究，那么非编码基因呢？这个时候大部分人估计都会疯狂抓头发（当然专门研究这一类基因的除外）！诶~，千万别抓，伯小远要来拯救你原本就不多的头发了，保护自己的头发从现在开始！
对于非编码基因，伯小远打算以microRNA和lncRNA为代表，给大家系统的讲一讲！但是，由于篇幅有限，今天就先给大家讲讲microRNA，后期会给大家呈上lncRNA的研究方法，到时候记得围观哦！
1、microRNA
在对microRNA的研究方法进行介绍之前，先解释一下它的定义：microRNA（miRNA）是一类内生的长度约20-24个核苷酸的小RNA，是发夹结构约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的。具体的介绍和功能大家可以参考之前的公众号文章：乘风破浪的microRNA，这里就不再做过多的介绍！
1.1 microRNA的过表达
如果我们想对一个microRNA进行过表达研究，那么首先要进行两步操作，第一，找到要目的microRNA的前体序列；第二，构建强启动子驱动pre-miRNA表达的过表达载体。做完这两步之后，后续的实验大家就可以根据自己的实验目的进行研究，需要稳定转化就进行稳定转化，不需要稳定转化用瞬时转化体系研究也行，只要满足实验需求就可以！
这里提供两个寻找microRNA前体序列的网站：
①miRBase：（不限物种）
②PmiRKB：PmiRKB Homepage (zju.edu.cn)（只针对水稻和拟南芥）
图1 microRNA过表达载体构建示意图
举个栗子：
2013年发表在Nature biotechnology上的一篇文章“Overexpression of microRNA OsmiR397 improves rice yield by increasing grain size and promoting panicle branching”中，过表达microRNA OsmiR397可以下调其靶基因OsLAC的表达，进而增加粒径和穗分枝，最终提高水稻产量。
在这篇文章中，水稻miR397的过表达植株，就是将pre-miR397a、pre-miR397b的基因组DNA序列克隆到CaMV35S启动子与Nos终止子之间，稳定转化水稻得到的。类似这样的文章还有很多，大家有兴趣的话可以自己去下载阅读哦，这里就只是给大家介绍一下microRNA过表达的方法！
图2 野生型、OXmiR397a、OXmiR397b和OXLAC转基因植株的表型(Zhang et al., 2013)。
1.2 microRNA的沉默
传统的基因功能研究依赖于遗传突变体的获得(Till et al., 2003)，但是miRNA序列非常短，而且许多miRNA家族是由多个成员组成的，具有潜在的重叠功能，因此这种遗传方法不太适用于miRNA。通常，研究miRNA的功能一般是通过研究其靶基因的转基因株系，进而间接来表征该miRNA的功能。然而，一个miRNA通常调节多个具有冗余或不同功能的靶基因，这种方法只能部分揭示特定miRNA在体内的功能。既然常规的CRISPR/Cas9以及研究miRNA靶基因的方法都不能很好的研究miRNA的功能，那么用什么方法可以解决这个问题呢？下面介绍一个破环内源性miRNA的有效方法——STTM。
2012年发表的一篇比较经典的关于降低microRNA功能的文章“Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis”中，介绍了拟南芥中短串联靶标模拟物（STTM）的表达可以对miRNA进行有效的破坏。
在拟南芥(Franco-Zorrilla et al.，2007)中发现了一种被称为靶标模拟物（TM）的内源性调节机制来调节miR399的活性。IPS1作为一个磷酸盐饥饿诱导基因，它的转录本与miR399部分互补，因此，miR399/IPS1 RNA双链形成一个中央凸起，有效地阻止了miR399对IPS1 RNA的切割(Franco-Zorrilla et al., 2007)。由于IPS1不影响miR399的丰度，但降低了其调节PHO2（miR399的靶基因）的能力，因此认为IPS1通过TM隔离miRNA抑制了miR399的活性。
受到上面的启发，探索一种有效阻断内源miRNA的方法势在必行！因此作者测试了更短的非编码RNA （sncRNA）（与IPS1相比）是否能有效阻断内源性miRNA的功能，作者设计并表达了一个108个核苷酸的人工sncRNA，称为STTM，用它来阻断miR165/166家族的功能。作者在这里之所以选择miR165/166家族是因为它有一组明确定义的靶mRNA，这些靶mRNA编码III类同源域/亮氨酸拉链（HD-ZIPIII）转录因子，包括PHABULOSA（PHB）、PHAVOLUTA（PHV）、REVOLUTA（REV）、ATHB8和ATHB15(Mallory et al., 2004；Reinhart et al., 2002；Zhong and Ye, 2007)。以往的研究表明，这些基因是由miR165/166通过靶标切割调控的(Tang et al., 2003)。miR165/166对这些靶mRNA的调控缺失预计会产生明确的表型；例如，功能获得等位基因phb-1d是一种显性突变，它破坏了PHB基因中miR165/166的结合位点，最终导致顶端优势的缺失和叶片对称性的改变。
对于上面提到的STTM结构，作者命名为STTM165/166-48（图3A），包含两个不完全匹配的miR165/166结合位点（24个核苷酸），一个是miR165，另一个是miR166，由48个核苷酸RNA间隔连接。STTM165/166-48包含3个额外的核苷酸（CTA），从而在STTM165/166-48和miR165/166之间的miRNA的10-11位置附近形成一个预防剪切的凸起。STTM165/166-48在转基因拟南芥中是以2×35S启动子和35S终止子进行表达的。
与含有miR165靶标模拟物（MIM165）的转基因植株（以IPS1为基础的针对miR165/166的TM构建物(Todesco et al., 2010)）相比（图3B），STTM165/166-48转基因植株表现出更严重的多效性发育缺陷，与phb-1d突变体的发育缺陷相当（图3B）。除了顶端结构缺失外，转基因植株还表现出典型的叶片不对称缺失（图3B）。在筛选的30多株T1 代STTM165/166-48转基因植株中，约90%表现出上述表型，而单独使用空载体转化的植株均未表现出上述表型，说明这些表型变化是由STTM165/166-48引起的，且表型世代稳定遗传。这些初步结果表明，在拟南芥中表达的108-核苷酸STTM165/166-48能够有效抑制miRNA165/166的活性。
为了确定STTM是否能够阻断miR165/166的功能，作者检测了miR165/166靶mRNA的水平。与预期一致，在STTM165/166-48转基因植株中，所有靶标（PHB、PHV、REV、ATHB8和ATHB15）均有不同程度的上调，而在空载体对照转基因植株中没有上调（图3C和3D）。另外，作者还专门比较了转基因植株MIM165、phb-1d和STTM165/166-48中PHB的表达水平，发现STTM165/166-48中PHB的表达水平略低于phb-1d，但明显高于MIM165（图3 C）。综上所述，上述数据强烈支持STTM165/166-48抑制了miR165/166的活性。
图3 STTM165/166-48诱导了拟南芥发育过程中的显著变化(Yan et al., 2012)。（A）STTM165/166-48结构示意图。橙色表示间隔区域和间隔序列。蓝色表miRNA结合位点的凸起序列。红色表示miR165和miR166之间的不同核苷酸。（B）3周龄转化了STTM165/166-48载体和空载体以及MIM165和phb-1d拟南芥的表型比较。phb-1d是Landsberg erecta背景中PHB（AT2G34710）基因的显性突变，该突变破坏了miR165/166与PHB mRNA的结合。Bars = 1.0cm。（C）在STTM165/166-48转基因拟南芥中对目的基因PHB进行qRT-PCR分析，并与空载体对照、MIM165和phb-1d植物进行比较。（D）对STTM165/166-48转基因拟南芥中miR165/166选定的靶基因进行qRT-PCR分析。
以上就是植物中抑制microRNA的研究方法，思路和原理介绍的都已经很详细了，以后不要再问伯小远microRNA能不能做敲除这种问题啦！
1.3 microRNA的检测
在前面已经介绍了microRNA的过表达和沉默方法，那么怎样知道我们的转基因有没有成功呢？由于microRNA不能翻译成蛋白，所以就只能在转录水平上进行检测，microRNA一般只有21 ~ 23个碱基，怎么检测？如果进行定量PCR检测，传统PCR引物长度约为20个碱基对，因此设计PCR引物具有一定的技术难度。另外，除了用定量PCR的方法，还有没有别的方法？问题有点多，但是别怕，听伯小远慢慢为你解答！
目前用于检测microRNA表达的方法包括定量PCR （qPCR）、Northern blot、微阵列和RNA测序。我们这里主要介绍用的比较多的两种方法——定量PCR和Northern blot。
1.3.1 定量PCR法
由于成熟miRNA序列较短序列反向互补，使用常规的方法直接进行反转录与定量是无法进行的，因此我们需要延长成熟miRNA的序列，其方法有茎环法和加尾法两种形式。
1.3.1.1 茎环法
利用茎环法对microRNA进行定量，步骤如下：
（1）需要有Stem-loop RT引物，该引物是由一个茎环结构（Stem-loop）的序列加上6-8个成熟microRNA的3’端反向互补碱基组成（即图4中步骤一上面的蓝色RT-primer），茎环结构一般在公司都能买到；
（2）Stem-loop RT引物在逆转录酶的作用下，通过3’末端的6-8个碱基与成熟miRNA互补配对得到逆转录产物cDNA（即图4步骤一下面的蓝色Stem-loop结构加上与microRNA互补配对的绿色箭头）；
（3）设计荧光定量PCR的上下游引物，其中上游引物包含microRNA序列序列反向互补，但是需要将U替换成T，另外3’末端的6-8个碱基不包含在引物内，下游引物是与Stem-loop中一段相匹配的序列，是通用引物。
（4）利用得到的逆转录产物cDNA、荧光定量引物以及TaqMan探针进行荧光定量PCR。
图 4 茎环法 miRNA定量检测的原理(Chen et al., 2005)。
1.3.1.2 加尾法
利用加尾法对microRNA进行定量，步骤如下：
（1）通过Poly A聚合酶在miRNA的3’末端添加Poly A尾，增加其长度（如图5黄色方框标出部分）；
（2）在逆转录酶的作用下，在microRNA的3’端添加带有通用序列（Tag）的Poly T引物进行反转录得到逆转录产物cDNA；
（3）设计荧光定量PCR的上下游引物，上游引物设计原则与茎环法一致，注意需要将“U”替换成“T”，PCR下游引物是通用引物，不过不同的公司提供的序列可能不一致；
（4）用miRNA特异性正向引物（绿色）和通用反向引物（橙色）进行qPCR。
图5 加尾法 miRNA定量检测的原理(Lu et al., 2017)。
对于加尾法，还可以在microRNA的5’端添加一个通用适配器，以便在qPCR之前进行可选的通用预扩增，该操作可以用引物/探针检测非常低丰度的靶标。与不添加5’端适配器的加尾法相比，添加之后的加尾法在得到逆转录产物cDNA之前多了一步PCR过程，其它步骤与普通加尾法一样。
图6 添加5’端适配器的加尾法原理(Lu et al., 2017)。
上面介绍了microRNA两种定量PCR的方法，那么我们在实际的实验中怎么选择呢？
如果检测需要较高的灵敏性和特异性，可以考虑茎环法；另外，在检测通量上，茎环法属于特异性逆转录，一次逆转录只能检测一个microRNA，而加尾法属于高通量逆转录，一次逆转录可检测多种microRNA。
MicroRNA的定量PCR的案例这里就不列举了，最终的呈现结果和普通基因的定量PCR结果其实没啥差别，大家有兴趣的话可以自己去看相关文献哟。
1.3.2 Northern blot法
Northern blot又称RNA印记法，是分子生物学、生物化学中常用的实验方法，可通过探测样品中RNA（或隔离mRNA）含量来研究基因的表达。
其原理与Southern blot相似，RNA样品经过凝胶电泳后会按照大小分离，然后将样品从凝胶转印到膜上，并用与目标序列互补的标记探针进行杂交，之后进行显影或显色，可以显示目标RNA所在位置，而显影强度则可指示目标RNA在所测样品中的相对含量。
图7 Northern blot实验原理图。
虽然检测基因表达的方法有很多，常用的是qPCR，但Northern blot 灵敏度高，与qPCR 相比有较高的特异性，可以有效的减少实验结果的假阳性，因此，Northern blot 实验被认为是检测基因表达的准确方法。
举个栗子：
还是在文章一开始列举的那个栗子中，作者为了评估OsmiR397对水稻性状的影响，构建了OsmiR397的过表达品系，其中OsmiR397a和OsmiR397b是OsmiR3977的两个亚型，Northern blot结果显示，这些OXmiR397转基因株系中miR397的表达均有不同程度的升高（图8）。
图8 miR397在OXmiR397a、OXmiR397b和OXmmiR397的T3代转基因品系中的Northern blot结果，其中tRNA作为对照(Zhang et al., 2013)。
小 结
上面介绍的方法是研究一个基因最基础的方法，非编码RNA与常规基因的研究思路其实是一样的，但是由于非编码RNA的特殊性，在具体的研究中需要根据具体的问题具体分析，好了，本篇关于microRNA的研究方法就介绍到这里了，后续的功能研究就交给大家自己了！
小远叨叨
以上的研究方法是针对microRNA基因本身的，千万不要把沉默microRNA的方法和microRNA的功能搞混淆了，microRNA作为非编码基因，其功能是抑制其靶基因转录后的表达，而沉默microRNA用到的方法是STTM，相信看过这篇文章的童鞋以后都不会再搞错了！
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