上次的文章中介绍了使用MEGA-X选择最优模型并构建进化树的操作步骤，但除了构建进化树之外，MEGA-X还有很多其他功能值得探索，今天要介绍的是用MEGA-X中的「CLOCKS」来推断物种分化时间。
在文献中，我们有时会看到下面这种进化树，上面标注了每个分支的进化时间，可以帮助作者探究环境对生物的影响以及宿主与寄生微生物的分化一致性等。那这些进化时间都是怎么推断的呢？
在MEGA-X中我们可以通过「分子钟」技术来追溯生物进化的历程，这种技术通过直接对比不同物种间基因的碱基排列顺序来推断进化时间，揭示生物进化历史。
分子钟有时也被称为「进化钟」或「基因钟」，由于地球上的所有生命都会从上一代体内继承DNA 遗传基因，且这种遗传基因会随着时间的变化而逐渐改变（即按一定的速率发生碱基突变），因此运用分子钟技术便可以将生物进化的起始时间大致地预测出来。
（图片引自文献Gerth M et al. . Nature Microbiology, 2016）
接下来我们来试一下用MEGA-X的RelTime方法来推断一下进化时间，首先在推断前需要准备的文件有以下几个：可用于推断分化时间的系统发育树（注意这里的发育树上需要有外类群以及校准点）的序列文件以及Newick格式的树文件。
在分子钟推断进化时间的过程中，最重要的找到至少一个校准点（即已确定分化时间的发育树节点），只有校准点准确，其他推断信息才会有意义并且可靠。
校准信息主要依赖于化石记录，但也有一些其他来源，比如年龄地质事件，因此一定要对文献进行详细评估得出校准信息。听起来比较复杂，但是有一个很神奇的网站可以帮助我们——TimeTree，这是一个通过生命树（thetreeoflife）不同分支的特异性分子钟时间推算来预测不同物种分化时间的数据库，可以通过MEGA-X直接访问（右上角）。
除此之外，还有一些非常有用的网络资源可以提供化石信息，例如化石校准数据库（）和古生物学数据库（）。无论使用哪种方式寻找校准点，在进行分子钟分析之前都要确保校准信息是准确的，获得了系统发育和校准边界，就可以用MEGA-X中的RelTime来推断进化时间了。
打开MEGA-X软件，点击右上的钟表图标「CLOCKS」。
点击CLOCKS后点击Compute Timetree。可以选择下面三个选项：RelTime-ML，RelTime-OLS和RelTime-Branch Length。RelTime-ML是最传统常用的方法，大多数情况选这个就可以。
打开后，展示以下界面，需要导入的文件有序列信息和树文件，然后选择外类群（outgroup）和校准点。在这里我们导入了.meg格式的数据文件和.nwk格式的树文件。
导入文件后，选择外类群，所谓外类群是指为了探知内类群（指定被研究的对象）的演化关系而借助比较的外部类群，它与内类群在演化关系上是最为接近的类群，具有最相近的祖先，且在进化程度上低于内类群。
下一步添加校准点。点击Add Constraints后，再点击左上角的「添加时钟」的图标，就可以进行选择，然后输入校准点分化时间的最大值和最小值，在这里分化时间主要可以依据文献中的数据或者从TimeTree中进行推断（TimeTree 仅仅能推断到属）。此处输入第一个校准点，大肠杆菌和沙门氏菌mega进化树，它们的分化时间是140MYA（百万年前）（U. Bergthorssonet al..Molecular Biology & Evolution, 1998）。
在这里我们再添加一个校准点，这个校准点我们用TimeTree来搜索进化时间（只能精确到属水平），可以点击右侧TimeTree图标进入官网，也可以通过网址直接访问，搜索选项中有以下三个选择：NODE TIME（输入两个物种，推断它们之间分化的时间节点）、TIMELINE（输入一个物种，推断它在自然界中出现的时间）、TIMETREE（输入大于属水平的一类物种如芽孢杆菌科，推断其下级分类学单位的物种之间分化的时间节点）。
在这里我们选择NODE TIME进行搜索。输入两个物种的名称，在这里我们输入Escherichia（埃希氏菌属）和Acidithiobacillus（嗜酸硫杆菌属）进行搜索。
结果显示如下，左边图中不同的颜色表示不同的地球条件，比如大气中氧气、二氧化碳、光照条件的变化等。中间的框中可以选择图片对哪些信息进行展示，哪些进行隐藏，最后调整好之后可以选择导出图片，格式可以选择JPG、PDF、SVG、PNG几种。右侧显示了TimeTree推断的进化时间，也就是我们输入校准点信息时要用到的时间信息，在这里显示为2621MYA。
在左图中右上方有一个黑色的实心圆圈，点击这个圆圈，在图片的下方就会显示引用的文献。
然后我们根据TimeTree的推断的校准时间来添加第二个校准点。
在进行下一步前，我们再演示一下TimeTree中其他两种方法TIMELINE、TIMETREE的操作。TIMELINE中要求输入一个物种分类名称，可以帮你推断一下该物种的分化时间，比如在此处我们输入Bacillus，搜索后显示结果如下图，在这里分化时间只能定位到科水平。
TIMETREE根据输入的物种名称，构建该分类学单位以下物种的系统发育树，点击每个圆圈都会有更详细的信息展开，实心的圆直接展示NCBI中分类的节点，空心圆是无名的未标记的分类节点。左侧的工具栏中可以对进化树和图像进行修改。并且可以导出图片和树文件。
TimeTree的简单使用介绍到这里，更加详细的内容可以去参考TimeTree的文献。可以看到mega进化树，TimeTree在线软件只能预测到数据库中包含的物种的分化时间，而一些不在数据库里的物种的分化时间我们可以借助MEGA-X来完成推断。回到MEGA-X中，点击OK，进入下一步，点击Set Options，选择默认参数即可。
稍等片刻，就会出现结果。每个分支上都有通过分子钟推断的进化时间。让我们再给它伸展下枝条，对枝条的长短、粗细以及字体的格式进行简单的修改美化，最后这棵利用分子钟推断了进化时间的系统发育树就建好了。进一步的美化可以将SVG格式图片导入到AI中进行操作。
通过以上对MEGA-X以及一些其他网站工具的介绍，相信大家对物种进化时间的推断有了简单了解，还有更多工具和方法值得我们探索，MEGA-X使用的介绍就到这里，以后有机会再介绍下链接到DATAMOKEY 等网站计算进化压力以及运行命令行版MEGA-X来构建进化树。
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